文/东观
编辑/东观
前言缺血性脑中风（Ischemicstroke,Ischemicstroke）是由颅内缺血、缺氧引起的一种脑缺血病变。
目前，国际上普遍使用的治疗手段为溶栓治疗，但是，治疗中存在脑出血和脑缺血的风险，因此有很大的缺陷。
药物疗法分为两种，一种是合成类，另一种是天然类，人工合成的抗癫痫药是一种较为常用的药物,而中药中的药性较为平和，副作用较小，且适宜于长期服用。
异黄酮是一类广泛分布于多种植物中的多羟基杂环，具有多种重要的生物学活性，如抗癌、抗老年痴呆和抗炎症等。
目前已有关于葛根在缺血性脑卒中疗效的报道。
文献报道中明确表示，葛根异黄酮对缺血性中风患者具有较好的治疗效果，但葛根的具体机制目前尚不清楚。
因此，我们得出结论：葛根素是一种具有良好神经保护作用的新型中药，具有显著的临床应用前景。
材料与方法（1）细胞株
大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤克隆化细胞株（PC12细胞），来源中国科学院上海细胞库。
(2)药物与试剂
葛根异黄酮、乳酸脱氢酶试剂盒、活性氧测试箱、2、5-二苯基四氮唑、悬浮细胞（MTT）实验。
方法（1）细胞培养
细胞复苏：将冻存的细胞管放在37℃的水浴中，这一步要迅速平稳，然后轻轻摇晃，移动细胞悬液并补加完全培养液（含10%胎牛血清和1%青霉素链霉素双抗溶液的高糖DMEM培养基），混匀后于37℃，5%CO2培养箱中进行培养。
定期对其粘附状况进行监测，并适时改变培养基，以消除冷冻后的血清对其造成的不良影响。依据细胞的状况，隔1-2日更换培养基。
（2）实验分组及处理
将发育状况较好的细胞制成1×105个/L的细胞悬浮液，接种于96孔板上，并在100μＬ进行24小时的培养，并将其分成3个不同的对照组。
对照组（C)：不添加OGD，用完整的培养基进行24小时的培养。
模型组（M)：取高浓度Na2S2O4(10mmol/L)，取其原代培养液，再取其原代培养液孵育24小时，建立体外缺血再灌注氧糖剥脱/复氧（OGD/R）大鼠缺血性中风模型。
药物组（Y）：分别给予100μg/mL、150μg/ml、200μg/ml的葛根异黄酮，阳性药依达拉奉给药组。
在OGD/R治疗结束后，将其转入含有100、150、200ug/mL及10ug/mL依达拉奉的完整培养基中，进行24小时的孵育，以确定其是否具有复氧及复糖能力。
（3）细胞存活率的测定
采用MTT法测定体外培养的小白鼠体内成瘤能力，将上述细胞按照1：4：2的方法进行处理，然后添加10uL/孔MTT，在CO2中温育4小时。
移去介质后，添加100uL/孔道DMSO，使其完全溶于紫色甲臜，用酶标记法测量其在490nm的吸收，并计算其相对活性。
（4）细胞内ＬＤＨ释放量的测定
采用LDH细胞毒试验方法，分析了LDH在体外的胞内的释放情况。将96孔平板上的培养基按照1：4：2的方法进行处理，取80uL/uL的96孔平板上的培养基，加入40uLLDH工作溶液，在室温暗光下培育30分钟。
（5）细胞内ＲＯＳ检测
按照1：4：2的程序对细胞进行处理后，在37℃的光线下，用10µmol/L，组织活性氧检测试剂盒（DCFH-DA）对原代细胞（PC12）进行30min的孵育，再用无血清的介质对其进行洗涤。
使用多功能读取装置来测量其荧光强度，以对照组的百分数来表达，并且为了消除细胞密度对其的影响，在进行MTT处理之后，将其进行归一化，然后再进行MTT，来获得其荧光强度。
（６）细胞内Ｃａ２＋含量检测
采用钙离子荧光探针（Fluo-3AM）对Ca2 进行测定，按照1：4：2步骤对细胞进行处理之后，用Fluo-3AM(2.5μmol/L）在37℃避光温育60min，再装载荧光探针。
之后进行清洗，除去细胞外染色物，在激发波长和发射波长下对荧光进行检测，设定波长为488nm和530nm。然后进行MTT处理，得到最后的荧光信号。
（７）流式细胞术检测细胞凋亡率
首先在6孔板上种植单层的细胞，按照1：4：2的方法进行造模处理和药物处理，然后将每一组的细胞分离出来，采集上清。
用胰酶水解后，每分钟1500r/分钟离心5分钟，用预先冷却的PBS冲洗2次，用组织凋亡结合剂重新悬浮。
用5uL的结合剂及碘化丙啶染色，在室温存放15分钟后放入冰浴，用流式细胞仪测定1小时后的凋亡，观察其对细胞的影响。
（８）各组细胞中Ｂｃｌ－２和ＢＡＤ蛋白表达水平的检测
各组细胞中Bcl—2和BAD蛋白表达水平的检测，用细胞蛋白裂解抽提试剂盒提取细胞总蛋白，用蛋白质定量法测定蛋白的浓度。
取40μｇ蛋白，经10％的SDS－PAGE分离后，转移至PVDF膜上，用５％脱脂奶粉于室温封闭１ｈ，分别加入BcL—2和BAD抗体（1∶1000稀释）及GAPDH单克隆抗体（1:10000稀释），于４℃培养过夜；
TBST洗涤５～６次，每次５～1０ｍｉｎ，加入HRP标记的羊抗兔IgG（1:1000稀释），室温培养60min；TBST洗涤３～４次，直至ECL显影。
(９)数据处理
所得资料经SPSS13.0统计处理后，以平均数±标准偏差进行统计处理。经t检验，P<0.05具有明显的显著性。
实验结果(1)葛根异黄酮对正常ＰＣ１２细胞存活率的影响
从（表1）可以看出，当将100、150、200μg/mL的葛根异黄酮与PC12细胞作用24小时后，其细胞存活与健康对照相比没有明显的差别。
表明该制剂在一定的剂量下对PC12细胞无明显的毒副作用，或其毒副作用微乎其微，这为以后的有关指标测定奠定了基础。
(2)葛根异黄酮对Ｎａ２Ｓ２Ｏ４诱导的ＰＣ１２细胞存活率的影响
从（表2）可以看出，正常组的细胞存活率是100%，而与正常组的细胞相比，正常组的细胞存活率降低到63%(P<0.01)。
与模式组相比，三种不同剂量的葛根异黄酮100、150、200μg/mL以及使用依达拉奉时的细胞存活均明显提高（P<0.01、P<0.05）。
（３）葛根异黄酮对Ｎａ２Ｓ２Ｏ４诱导的ＰＣ１２细胞ＬＤＨ释放率的影响
由（表3）可见，正常组织中乳酸脱氧酶（LDH）的释放速率为46.48%，与正常组织相比，模拟组织中LDH的释放速率突然提高到了86.6%(P<0.01)，二者有非常明显的差别。
结果表明，在两种浓度下，葛根异黄酮（150,200μg/mL）的LDH的释放速率明显低于模型组（P<0.01、P<0.05）。
（４）葛根异黄酮对Ｎａ２Ｓ２Ｏ４诱导的ＰＣ１２细胞内Ｃａ２＋浓度的影响
由（表4）可见，实验组的Ca2 含量明显高于对照组（P<0.05)。
3种给药方式，表明葛根中的黄酮类成分能有效地阻止Ca2 的积累，进而减少CaO引起的细胞凋亡。
（５）葛根异黄酮对Ｎａ２Ｓ２Ｏ４诱导的ＰＣ１２细胞内ＲＯＳ的影响
从（表5）可以看出，正常对照的细胞的平均发光强度是100%，而模拟组的细胞的平均发光强度是186.6%(P<0.01)，与正常对照相比，模拟组有明显提高（P<0.01）。
（６）流式细胞术检测各组细胞凋亡率
从（图1、图2）可以看出，对照组及模式组分别为13.39%及31.81%，在OGD/R处理后，模式组的凋亡比率显著大于对照组。
葛根异黄酮（100μg/mL），对肿瘤的杀伤作用可达到31.75%，与依达拉奉治疗后的治疗效果均明显优于正常对照组（P<0.0.1）。
（７）各组细胞中Ｂｃｌ－２和ＢＡＤ蛋白的表达水平
从图3A及3B可以看出，大鼠Bcl-2及BAD蛋白质表达的比例明显低于正常组（P<0.01)；在给予依达拉奉的情况下，两种药物处理后的肿瘤组织中，Bcl-2与BAD的表达比例均显著高于对照组（P<0.01）。
我们前期研究发现，200ug/mL的葛根素可以通过提高Na2S2O4诱导的Bcl-2和BAD的表达水平，起到抑制Na2S2O4诱导的细胞凋亡的效果。
结语我们前期研究表明，传统的脑梗死动物模型，在给予葛根异黄酮后可显著减轻脑梗死动物模型的损害程度。
在OGD/R处理后，葛根异黄酮对LDH的释放有不同的抑制作用；减少活性氧的含量，减少活性氧的累积；在此基础上，我们提出了一个新的治疗策略：通过调节Ca2 浓度，减少了肿瘤细胞的凋亡。
在缺血性脑损伤中，细胞凋亡是导致神经元死亡的主要原因，Bcl-2可抑制谷胱甘肽（GSH）的分泌，减少细胞内的ROS水平，进而发挥抗肿瘤作用。
BAD（Bcl-2）是一种重要的细胞凋亡调控因子，其只含有（******）BH3区域，而BAD与Bcl2的相互作用与调控机制尚不清楚。
BAD可通过与Bcl-2相结合，并通过拮抗剂Bcl-2对线粒体自噬的影响来调节其对肿瘤细胞凋亡的影响。
我们前期工作中，首次证实了葛根素能够促进Bcl-2、BAD的转录。
因此，我们得出：葛根素的有效成分很有可能是通过抑制神经细胞凋亡，降低神经细胞的损伤来达到抑制病菌的效果。
以上研究成果将从多个层面证实其对缺血性脑卒中的保护作用。然而，离体实验只是初步探索其成药性的物质基础，还需通过相应的体内实验对其进行深入的结构-活性评价。
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